植物提取物的5種常見檢測(cè)方法 |
發(fā)布時(shí)間:2020-07-20 18:44 點(diǎn)擊數(shù): |
目前植物提取物的檢測(cè)方法常見的有五種,分別為:高效液相色譜分析法(HPLC)、紫外吸收光譜分析法(UV)、薄層色譜分析法(TLC)、氣相色譜分析法(GC)和原子吸收光譜分析法(AAS)。
每一種方法的作用原理和應(yīng)用都各不相同。其中,HPLC和UV為標(biāo)準(zhǔn)植物提取物的常用檢測(cè)方法,TLC被用于比例植物提取物的檢測(cè),GC用來檢測(cè)揮發(fā)性液體或油類,AAS用于提取物重金屬含量的檢測(cè)。
1、高效液相色譜分析法(HPLC)
HPLC全程是HighPerformanceLiquidChromatography(高效液相色譜法),又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支,以液體為流動(dòng)相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。高效液相色譜法(HPLC)是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的一種分析方法。近年來,在保健食品功效成分、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測(cè)定等應(yīng)用廣泛。世界上約有80%的有機(jī)化合物可以用HPLC來分析測(cè)定。
1.1高效液相色譜分析的流程
由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng),然后輸出,經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后,導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入,并隨流動(dòng)相通過色譜柱,在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器,檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理,并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似,不同的是氣相色譜改變溫度,
而HPLC改變的是流動(dòng)相極性,使樣品各組分在最佳條件下得以分離。
1.2高效液相色譜的分離過程
同其他色譜過程一樣,HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
開始樣品加在柱頭上,假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分,A、B和C,隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱,開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留,較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(zhǎng),較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A,C之間,第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng),則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱,達(dá)到分離之目的。
不同組分在色譜過程中的分離情況,首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異,這是熱力學(xué)平衡問題,也是分離的首要條件。其次,當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí),譜帶隨柱長(zhǎng)展寬,分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。
2、紫外吸收光譜分析法(UV)
UV檢測(cè)法也是植物提取物常用的檢測(cè)方法之一,UV是英文名稱ultraviolet的縮寫,UV檢測(cè)也稱紫外檢測(cè)法、紫外光譜檢測(cè)法。UV檢測(cè)法主要用于配合物組成及其穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定,定量分析結(jié)構(gòu)分析定性分析應(yīng)用范圍定義紫外光譜是分子中某些價(jià)電子吸收了一定波長(zhǎng)的電磁波,由低能級(jí)躍近到高能級(jí)而產(chǎn)生的一種光譜當(dāng)分子中的電子吸收能量后會(huì)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),然后放出能量(輻射出特征譜線),回到基態(tài);而輻射出特征普線的波長(zhǎng)在紫外區(qū)中就叫做紫外光譜(UV)
紫外光來自于一個(gè)水銀紫外燈,水銀紫外燈是通過藍(lán)寶石窗口以及過程流來獲取的。除了特定的紫外波長(zhǎng),狹窄的波段通過紫外過濾器阻塞了所有的傳輸光線。這些紫外光能夠通過過濾器以及測(cè)試探測(cè)器只記錄特定的紫外波長(zhǎng)。
紫外光直接通過靠近燈的相同規(guī)格的紫外過濾器。參考探測(cè)器置于過濾器后邊,可以測(cè)試出當(dāng)前的紫外強(qiáng)度。參考探測(cè)器信號(hào)用于彌補(bǔ)由于燈管老化,極端溫度變化等引起的紫外資源強(qiáng)度的起伏變化。通過測(cè)量及參考探測(cè)器給到的光電流結(jié)果將會(huì)通過傳送器進(jìn)行放大,修改,處理。傳送器實(shí)時(shí)的提供經(jīng)計(jì)算后的測(cè)量結(jié)果,且能夠向處理控制系統(tǒng)發(fā)送多個(gè)輸出值。
2.1UV定性分析
在有機(jī)化合物的定性分析中,紫外-可見光譜適用于不飽和有機(jī)化合物,尤其是共軛體系的鑒定,以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。此外,可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析,因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。一般有兩種定性分析方法,比較吸收光譜曲線和用經(jīng)驗(yàn)規(guī)則計(jì)算最大吸收波長(zhǎng)λmax,然后與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較。結(jié)構(gòu)分析??結(jié)構(gòu)分析可用來確定化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。如辨別順反異構(gòu)體和互變異構(gòu)體。
2.2UV定量分析
紫外-可見分光光度定量分析的依據(jù)是Lambert-Beer定律,即在一定波長(zhǎng)處被測(cè)定物質(zhì)的吸光度與它的溶度呈線性關(guān)系。應(yīng)此,通過測(cè)定溶液對(duì)一定波長(zhǎng)入射光的吸光度可求出該物質(zhì)在溶液中的濃度和含量。種常用的測(cè)定方法有:?jiǎn)谓M分定量法、多組分定量法、雙波長(zhǎng)法、示差分光光度法和導(dǎo)數(shù)光譜法等。配合物組成及其穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定??測(cè)量配合物組成的常用方法有兩種:摩爾比法(又稱飽和法)和等摩爾連續(xù)變化法(又稱Job法)。酸堿離解常數(shù)的測(cè)定??光度法是測(cè)定分析化學(xué)中應(yīng)用的指示劑或顯色劑離解常數(shù)的常用方法,該法特別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。
3、薄層色譜分析法(TLC)
薄層色譜(ThinLayerChromatography)常用TLC表示,又稱薄層層析,屬于固-液吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法,它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品(幾到幾十微克,甚至0.01μg)的分離;另一方面若在制作薄層板時(shí),把吸附層加厚,將樣品點(diǎn)成一條線,則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外,在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí),常利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。
薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板(10×3cm左右)上均勻的涂一層吸附劑或支持劑,帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線上,涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi),浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時(shí),將色譜板取出,干燥后噴以顯色劑,或在紫外燈下顯色。薄層色譜又叫薄板層析,是色譜法中的一種,是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù),屬固—液吸附色譜,它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn),一方面適用于少量樣品(幾到幾微克,甚至0.01微克)的分離;另一方面在制作薄層板時(shí),把吸附層加厚加大,因此,又可用來精制樣品,此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質(zhì)。此外,薄層色譜法還可用來跟蹤有機(jī)反應(yīng)及進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試”。
4、氣相色譜分析法(GC)
GC:GasChromatography氣相色譜法用氣體作為移動(dòng)相的色譜法。根據(jù)所用固定相的不同可分為兩類:固定相是固體的,稱為氣固色譜法;固定相是液體的則稱為氣液色譜法。
氣相色譜系統(tǒng)由盛在管柱內(nèi)的吸附劑,或惰性固體上涂著液體的固定相和不斷通過管柱的氣體的流動(dòng)相組成。將欲分離、分析的樣品從管柱一端加入后,由于固定相對(duì)樣品中各組分吸附或溶解能力不同,即各組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)有差別,當(dāng)組分在兩相中反復(fù)多次進(jìn)行分配并隨移動(dòng)相向前移動(dòng)時(shí),各組分沿管柱運(yùn)動(dòng)的速度就不同,分配系數(shù)小的組分被固定相滯留的時(shí)間短,能較快地從色譜柱末端流出。以各組分從柱末端流出的濃度c對(duì)進(jìn)樣后的時(shí)間t作圖,得到的圖稱為色譜圖。當(dāng)色譜過程為沖洗法方式時(shí),組分在進(jìn)樣后至其最大濃度流出色譜柱時(shí)所需的保留時(shí)間tR,與組分通過色譜柱空間的時(shí)間tM,及組分在柱中被滯留的調(diào)整保留時(shí)間t惱的關(guān)系是:
式中t惱與tM的比值表示組分在固定相比在移動(dòng)相中滯留時(shí)間長(zhǎng)多少倍,稱為容量因子k:
從色譜圖還可以看到,從柱后流出的色譜峰不是矩形,而是一條近似高斯分布的曲線,這是由于組分在色譜柱中移動(dòng)時(shí),存在著渦流擴(kuò)散、縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力等因素,因而造成區(qū)域擴(kuò)張。在色譜柱內(nèi)固定相有兩種存放方式,一種是柱內(nèi)盛放顆粒狀吸附劑,或盛放涂敷有固定液的惰性固體顆?!草d體或稱擔(dān)體(表2)〕;另一種是把固定液涂敷或化學(xué)交聯(lián)于毛細(xì)管柱的內(nèi)壁。用前一種方法制備的色譜柱稱為填充色譜柱,后一種方法制備的色譜柱稱為毛細(xì)管色譜柱(或稱開管柱)。
通常借用蒸餾法的塔片概念來表示色譜柱的效能,例如使用“相當(dāng)于一個(gè)理論塔片的高度“H或“塔片數(shù)”n來表示柱效。對(duì)于填充柱:
對(duì)于開管柱:
式中λ是與填充均勻性有關(guān)的因素,稱為填充不規(guī)則因子;γ是柱內(nèi)填充物使得氣體擴(kuò)散路徑彎曲的因素,稱為彎曲因子;dp是填充物平均顆粒直徑(即粒度);u是載氣在柱溫、柱壓下的線速;Dg是組分在氣相中的分子擴(kuò)散系數(shù);Dl是組分在液相的擴(kuò)散系數(shù);df是固定液的液膜厚度;dc是開管柱的內(nèi)徑。所以色譜柱的塔片數(shù)n=L/H,式中L為色譜柱長(zhǎng);n的數(shù)值可用給定的物質(zhì)作實(shí)驗(yàn),由實(shí)驗(yàn)所得到的色譜圖(圖1)計(jì)算得到:
式中ω┩為色譜峰的半高寬,由于氣相色譜的組分在固定液中的分配等溫線多為線性,如果進(jìn)樣量很小,得到的色譜峰流出曲線最初是用高斯正態(tài)分布來描述的,其數(shù)學(xué)表示式為:
現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)和理論上都證明了物質(zhì)的色譜峰形狀是不對(duì)稱的和曳尾的,若用指數(shù)衰減修正的高斯分布作為描述色譜峰形狀的分布函數(shù),則更為確切:
式中A表示峰面積;tG表示高斯峰的中心位置;σ表示高斯峰的標(biāo)準(zhǔn)方差;τ表示指數(shù)衰減函數(shù)的時(shí)間常數(shù);t′為積分變量。
上面曾經(jīng)指出,兩組分的分配系數(shù)必須有差異,其色譜峰才能被分開。有了差異,分離時(shí)所需的柱效n也就不相同,所以要判別兩色譜峰分離的情況(圖2),還需要采用色譜柱總分離效能指標(biāo)R:
n與R的關(guān)系為:
式中α′是組分相對(duì)保留值;α是組分校正相對(duì)保留值。從上式可知,選擇適宜固定液和具有給定塔片數(shù)的色譜柱后,應(yīng)該通過改變色譜柱溫來調(diào)節(jié)α′值,從而滿足將兩組分分離至給定R值的分離程度。
5、原子吸收光譜法(AAS)
原子吸收光譜法(AAS),全稱是AtomicAbsorptionSpectrometry
AAS基本原理:
每一種元素的原子不僅可以發(fā)射一系列特征譜線,也可以吸收與發(fā)射線波原子吸收光譜原理圖
長(zhǎng)相同的特征譜線。當(dāng)光源發(fā)射的某一特征波長(zhǎng)的光通過原子蒸氣時(shí),即入射輻射的頻率等于原子中的電子由基態(tài)躍遷到較高能態(tài)(一般情況下都是第一激發(fā)態(tài))所需要的能量頻率時(shí),原子中的外層電子將選擇性地吸收其同種元素所發(fā)射的特征譜線,使入射光減弱。特征譜線因吸收而減弱的程度稱吸光度A,與被測(cè)元素的含量成正比:式中K為常數(shù);C為試樣濃度;I0v為原始光源強(qiáng)度;Iv為吸收后特征譜線的強(qiáng)度。按上式可從所測(cè)未知試樣的吸光度,對(duì)照著已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列曲線進(jìn)行定量分析。由于原子能級(jí)是量子化的,因此,在所有的情況下,原子對(duì)輻射的吸收都是有選擇性的。由于各元素的原子結(jié)構(gòu)和外層電子的排布不同,元素從基態(tài)躍遷至第一激發(fā)態(tài)時(shí)吸收的能量不同,因而各元素的共振吸收線具有不同的特征。原子吸收光譜位于光譜的紫外區(qū)和可見區(qū)。
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